生物中分离色素的方法称为“层析”,也称为色层分析法或色谱法。即:利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同,达到彼此分离的目的。
由于色素的种类不同,被吸附的强弱不同,就在吸附柱(或滤纸等)上排列成为不同的色层,再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力,用不同的溶剂进行洗脱,从而达到色素的分离。
生物中分离色素的方法
纸层析法,色素在滤纸条上能分离的原因是四种色素随着层析液在滤纸上的扩散速度不同。四条色素带从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a,叶绿素b。
纸层析法原理是依据极性相似相溶原理,是以滤纸纤维的结合水为固定相,而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同,因而扩散速度不同,从而达到分离的目的。
试样经层析后可用比移值(Rf)表示各组成成分的位置(比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比),由于影响比移值的因素较多,因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。
作为单体鉴别时,试样所显主色谱斑点的颜色(或荧光)与供置,应与对照(标准)样所显主色的谱斑点或供试品-对照品(1∶1)混合所显的主色谱斑点相同。
作为质量指标(纯度)检查时,可取一定量的试样,经展开后,按各单体的规定,检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。作为含量测定时,可将色谱斑点剪下洗脱后,再用适宜的方法测定,也可用色谱扫描仪测定。
生物中分离色素实验要点及注意事项
1、实验中几种化学药品的作用
①加入少量SiO2,可破坏细胞结构,使研磨更充分,便于色素完全释放。
②加入少量CaCO3,可以中和细胞内的有机酸,防止有机酸夺取叶绿素中的镁离子使叶绿素破坏,从而起到保护色素的作用。但SiO2.和CaCO3的加入量要少,否则滤液杂质多、混浊、颜色浅,实验效果差。 2、实验成功的关键
①叶片要新鲜,颜色要深绿,保证色素的含量。
②研磨要迅速充分。叶绿素不稳定,易被破坏,时间过长或研磨不充分都会导致色素的量太少而使实验失败。
③滤液细线不仅要求细、直、均匀,而且要求含有较多的色素(可以重复画二至三次)。
④滤液细线不能触及层析液,否则色素溶解到层析液中,将得不到清晰的色素带。
3、注意事项
①制备滤纸条时,要剪去两角,这样可以减小边缘效应,使色素在滤纸上扩散均匀,便于观察实验结果。
②收集滤液后,要及时用棉塞将试管口塞紧,防止滤液挥发。
4、滤纸条上的滤液细线,不能触及层析液的原因:滤纸条上的滤液细线如触及层析液,滤纸上的叶绿体色素就会溶解在层析液中,实验就会失败。
5、提取和分离叶绿体色素的关键:
(1)提取叶绿体色素的关键是:①叶片要新鲜、浓绿;②研磨要迅速、充分;③滤液收集后,要及时用棉塞将试管口塞紧,以免滤液挥发。
(2)分离叶绿体色素的关键是:①是滤液细线要细且直,而且要重复划几次;②是层析液不能没及滤液线。
6、收集到的色素滤液绿色过浅,可能原因如下:
①未加二氧化硅,研磨不充分。
②使用放置数天的菠菜叶,滤液中色素(叶绿素)太少,绿色过浅。
③一次加入大量的95%的乙醇,提取浓度太低(正确做法:分次加入少量95%的乙醇提取色素)。
④未加碳酸钙或加入过少导致色素分子被破坏。
7、如果滤纸条色素带重叠,原因可能是滤纸条上的滤液细线接触到层析液。
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